Лабораторная работа № 3

Методы количественного определения активности ферментов

Работа 1. Количественное определение активности каталазы крови

(по Баху и Зубковой)

Цель – определить активность каталазы крови (по Баху и Зубковой)

Фермент каталаза (оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) содержится в большом количестве в эритроцитах и разлагает перекись водорода с образованием кислорода и воды по уравнению:

2Н2О2 → каталаза О2 + 2Н2О

При количественном определении активности каталазы крови измеряют или количество перекиси водорода, разложенной каталазой, или количество кислорода, выделившегося при этой реакции. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.

Каталазным числом называют количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл крови согласно следующей реакции:

2КМnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4→2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества КМпО4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Показателем каталазы называют дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

При количественном определении активности каталазы нужно сравнивать показатели каталазы, а не каталазные числа, так как фермент содержится почти исключительно в эритроцитах и притом не в гемоглобине, а в строме. Содержание каталазы в крови снижается при ряде заболеваний, таких, как рак, анемия , туберкулез и др.

Ход работы . 1. Приготовление раствора крови . В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды. 0,1 мл крови вносят в колбу с водой. Пипетку промывают несколько раз, набирая жидкость и выпуская её в мерную колбу. Доливают мерную колбу до метки водой, следовательно, кровь развели в 1000 раз и получили основной раствор крови, в 1 мл которого содержится 1 мкл крови. В этом растворе определяют каталазное число.

2. Приготовление опытных и контрольных проб . В две конические колбы на 25 мл (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного раствора крови. Контрольную колбочку кипятят в течение 2 мин для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения. После этого обе колбочки оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в каждую колбочку вносят точно 2 мл 1% раствора Н2О2 и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

3. Титрование и расчет . В каждую колбочку приливают по 5 мл 10% раствора Н2SO4 и оттитровывают содержимое колбочки 0,1 н. раствором КМпО4 до розового окрашивания.

Рассчитывают активность каталазы, исходя из того, что на титрование контрольной колбочки, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора КМпО4, чем на титрование опытной колбочки. Полученную разность умножают на 1,7 и получают каталазное число для исследуемой крови.

Пример расчета . Грамм-эквивалент Н2О2 равен 17 г. Следовательно, в 1 мл 0,1 н. раствора содержится 11,7 мг Н2О2. 1 мл 0,1 н. КМпО4 эквивалентен 1 мл 0,1 н. Н2О2; умножая 1,7 на разность между количеством миллилитров 0,1 н. КМпО4, пошедшего на титрование в контрольной и в опытной колбочках, получают количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, т. е. получают сразу каталазное число. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц.

Исходя из того, что в 1 мкл крови содержится около 5 млн. эритроцитов, можно рассчитать показатель каталазы:

Вывод

Работа 2. Определение активности каталазы сырого молока

Цель – определить активность каталазы сырого молока; на основании полученных данных отнести исследуемый объект к нормальному или анормальному молоку.

В основу метода положено определение количества разложенного ферментом пероксида водорода. Каталаза - двухкомпонентный фермент, димер, гемопротеид (в активном центре имеет протогематин). Молекулярная масса фермента 225000...230000, оптимум действия находится при рН 7,0...8,0 и температуре 20...40°С (рJ – при рН 5,4...5,7). Действие каталазы проявляется уже при 0°С, нагревание до 75...80°С разрушает её.

Возможный механизм действия каталазы описывается уравнениями:

Каталаза-FеОН + Н2О2 → Каталаза-FеООН + Н2О

Каталаза-FеООН + Н2О2 → Каталаза-FеОН + О2 + Н2О

Активность каталазы выражают в стандартных (Е) и международных (нкат) единицах, а также через объём кислорода, выделившегося из определенного объема молока при определенных условиях.

Зависимость между отдельными единицами активности каталазы: 1 Е = 16,67 нкат = 6,25 см3 кислорода.

Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы, содержится в альбуминовой фракции. Бактериальная каталаза накапливается в молоке при развитии микроорганизмов. Молочнокислая микрофлора каталазу не вырабатывает. Этой способностью обладают психротрофные и гнилостные бактерии. Поэтому определение активности каталазы можно использовать для контроля количества последних в молоке (она может составлять выше16,0 Е).

Повышенная активность каталазы в анормальном молоке позволяет также выявлять его примесь в сборном молоке.

Активность каталазы в свежевыдоенном молоке, полученном от здоровых животных, составляет 4,0 - 16,0 Е, в молозиве 50 - 94, в стародойном молоке – 37 - 50, в маститном - 62 Е и более.

Для определения активности каталазы используют полярографический, манометрический и перманганатометрический методы. Последний метод наиболее точен.

Сущность метода состоит в количественном определении пероксида водорода, разложенного каталазой, содержащейся в 1 см3 молока, за 1 мин при 25°С.

Неразложившийся пероксид водорода оттитровывают раствором перманганата калия в кислой среде (см. реакцию выше).

Количество разложившегося пероксида водорода находят по разнице между контрольным и опытным титрованием.

Ход работы . Перед началом работы часть исследуемого молока кипятят для разрушения каталазы.

В две конические колбы вместимостью 200 см3 пипетками вносят в первую - 2 см3 сырого молока (опытная проба), во вторую - 2 см3 кипяченого молока (контрольная проба). Температура молока (20 ± 1)°С. В обе колбы цилиндром добавляют по 98 см3 дистиллированной воды с температурой (20 ± 1)°С, содержимое колб перемешивают, колбы нагревают на водяной бане до температуры (25 ± 1)°С. Затем в обе колбы пипеткой добавляют по 25 см3 0,3%-ного раствора пероксида водорода, колбы закрывают пробками, их содержимое тщательно перемешивают; колбы помещают в термостат при температуре (25 ± 1)°С. Записывают время начала опыта.

Через 30 мин в обе колбы из бюретки вносят по 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титруют из бюретки раствором перманганата калия (Сэ = 0,1 моль/дм3) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Исчезновение окрашивания в более поздний срок связано с окислением органических составных частей молока.

Обработка результатов . Активность каталазы в стандартных единицах рассчитывают по формуле:

где Vk - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование контрольной пробы, см3;

Vo - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование опытной пробы, см3;

1,7 - масса пероксида водорода, соответствующего 1 см3 раствора перманганата калия с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/дм3, мг;

m - объем молока, см3 (m = 2 см3);

t - продолжительность выдержки молока с раствором пероксида водорода, мин (t = 30 мин);

0,034 - масса 1 мкМ пероксида водорода, мг.

После подстановки известных значений формула принимает вид:

АЕ = (Vk - Vo ) · 0,83 (Е)

Примечание. 1 . Предлагаемая методика измерения активности каталазы рекомендуется для исследования сырого молока с активностью каталазы не выше 20 Е. 2. При исследовании анормального молока следует брать для анализа не все разведение молока (100 см3), а 20 см3. В этом случае расчетная формула будет иметь вид:

АЕ = (Vk - Vo ) · 4,15 (Е)

Вывод

Работа 3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц

Цель – определить сукцинатдегидрогеназу мышц.

Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) очень распространена в тканях животных, растений и микроорганизмов, катализирует дегидрирование янтарной кислоты, при котором последняя превращается в фумаровую кислоту:

При добавлении в среду окисленной формы метиленовой синей, восстановленная сукцинатдегидрогеназа передает водород на метиленовую синюю, образуя бесцветное лейкосоединение:

Материалы исследования и реактивы:	Оборудование:
1. Гомогенат мышц (в 1 мл 100 мг ткани)	1. Пробирки химические
	2. Автоматические пипетки
а) 9,078 г однозамещенного кислого фосфорнокислого калия растворяют в 1 л прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды	3. Стеклянные палочки
4. Термостат
5. Ледяная баня
б) 11,867 г двузамещенного кислого фосфонокислого натрия (Na2HPO4·12H2O) растворяют в 1 л прокипяченной дистиллированной воды в) смешать полученные растворы в соотношении 1:1
3. Янтарная кислота, 0,01 н. нейтрализованный раствор
4. Метиленовая синяя, 0,05% раствор
5. Агар-агар

Ход работы . В две пробирки (опытную и контрольную) помещают 2 мл гомогената мышц. Содержимое контрольной пробы кипятят и охлаждают.

В обе пробирки наливают по 1 мл фосфатного буфера рН 6,8, по 2 мл 0,01 н. нейтрализованного раствора янтарной кислоты и по 2 капли 0,05% раствора метиленовой синей.

Заливают содержимое обеих пробирок 2 мл подогретого агар-агара и кладут их на лёд для застывания. Пробирки помещают в термостат при 37°С. Опыт считают законченным, когда в опытной пробирке жидкость будет почти бесцветной. В контрольной пробирке жидкость не изменяет окраску, поскольку фермент денатурируется при нагревании.

Критерием активности сукцинатдегидрогеназы является время обесцвечивания метиленовой синей в присутствии янтарной кислоты в анаэробных условиях.

Работа 4. Определение эффективности пастеризации молока пробой на

лактопероксидазу

Цель – определить активность лактопероксидазы, на основании полученных результатов отнести исследуемый объект к пастеризованному, либо непастеризованному молоку.

Способность пероксидазы выдерживать нагревание до 80°С положена в основу метода контроля высокотемпературной пастеризации молока (ГОСТ 3623-73. «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации»).

Фермент пероксидаза относится к классу оксидоредуктаз, катализирует окисление различных соединений в присутствии пероксида водорода вследствие выделения активного атомарного кислорода.

Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, димер, гликогемопротеид, его молекулярная масса составляет 76000 - 93000, имеет оптимум действия при рН = 6,0 - 7,0 и температуре 20 - 25°С (рJ фермента = 9,6). Фермент термоустойчив, инактивируется при температуре выше 80°С. Возможна его реактивация после нагревания. Механизм действия фермента описывается уравнением:

Н2О2 → О + Н2О

Нативная пероксидаза (лактопероксидаза) синтезируется клетками молочной железы; часть её поступает в молоко с лейкоцитами (миелопероксидаза). Фермент связан с альбуминовой фракцией молока.

В молоке содержится 3 - 10 мг% пероксидазы, в молозиве её содержание выше. Активность пероксидазы в свежевыдоенном молоке также довольно высока и составляет 370 нкат.

Лактопероксидаза вместе с тиоцианатом и пероксидом водорода входит в антибактериальную систему молока. Так, лактопероксидаза катализирует окисление тиоцианата, а образующиеся продукты (гипотиоцианат и др.) подавляют жизнедеятельность микроорганизмов, особенно грамотрицательных, в том числе патогенных.

Как указывалось выше, пероксидаза расщепляет пероксид водорода с образованием активного атомарного кислорода. Активный кислород окисляет йодид калия, при этом восстанавливается йод.

При наличии крахмала в реакционной смеси она принимает сине-фиолетовое окрашивание.

Ход работы. В пробирку вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 5 см3 исследуемого молока, 5 капель раствора йодкалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора пероксида водорода. Содержимое пробирки перемешивают после добавления каждого реактива. Через 2 мин анализируют окрашивание содержимого пробирки.

Оценка результатов . Если окрашивание молока в пробирке не изменилось, то фермент, пероксидаза в нем отсутствовал, следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 80°С.

Появление в пробирке сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии пероксидазы. Следовательно, молоко не подвергалось пастеризации или температура пастеризации была ниже 80°С, или пастеризованное молоко было смешано с непастеризованным.

Появление окрашивания в пробирках более чем через 2 мин после добавления реактивов, не указывает на отсутствие пастеризации, так как может быть вызвано разложением реактивов.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованного молока к пастеризованному.

Вывод

Вопросы

1. Какие вещества называются ферментами?

2. Каковы их химическая природа и свойства?

3. Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?

4. Как зависит активность ферментов от температуры?

5. Как влияет величина рН среды на ферментативную активность?

6. Какие вещества называются активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры

7. Какие качественные и количественные методы используются для изучения действия ферментов?

8. Что представляет собой единица активности ферментов?

9. На чем основан метод определения активности амилазы и каково диагностическое значение этого определения?

10. Как определяют активность каталазы крови?

11. Каковы основные принципы метода определения активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой)

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н 2 О 2 ) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2Н 2 О 2 → О 2 + 2Н 2 О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы : 1) 1% раствор Н 2 О 2 ; 2) 10% раствор серной кислоты ; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление : в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета : моль-эквивалент Н 2 О 2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н 2 О 2 ; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н 2 О 2 , которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы : каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

Показатель каталазы составляет 2-3х10 -:6 , в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н 2 О 2 (2 Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 ) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н 2 О 2 ; 2) 4 % раствор молибдата аммония.

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37 ° С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Е оп и Е хол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,210 3 – коэффициент экстинкции, ммоль –1 см –1 .

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6 + 0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.

Принцип метода: молибденовокислый аммоний с раствором перекиси водорода образует комплексное соединение желтого цвета. Каталаза разрушает перекись водорода по следующей формуле:

2Н 2 О 2 = 2Н 2 О + О 2

Степень снижения интенсивности окраски раствора пропорциональна активности каталазы.

Ход работы: в опытную и контрольную пробирку вносят по 4 мл 0,03% раствора перекиси водорода, в опытную пробирку добавляют 0,2 мл гемолизированной крови (разведение 1:1000). Ингибируют пробу 20 минут при 37 0 С. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл раствора молибдата аммония, а в контрольную – дополнительно 0,2 мл гемолизата. Перемешивают. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробы против воды при синем светофильтре. Определяют активность каталазы по формуле:

(Е к – Е 0) . 5600

А= -------------------, где

А –активность каталазы (мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл крови);

Е к –экстинция контроля; Е 0 – экстинция опыта;

В – время инкубации, мин; 5600 – коэффициент

В норме активность каталазы составляет 135 мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл

крови (в слюне –12-16 мкмоль). Активность каталазы в крови может снижаться при анемии, опухолевом росте, туберкулезе, некоторых других заболеваниях, а повышаться при острых воспалительных процессах (в слюне – при воспалительных процессах слизистой ротовой полости).

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1. Может ли осуществиться окисление СН 3 - СН 2 - СН 2 - ОН ®

СН 3 - СН 2 - СН = О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН 3 - СН 2 - СН = О ® СН 3 - СН 2 – СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции. Как пояснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции.

3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении?

4. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением вне организма? Назовите внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме. Назовите отличия между этими процессами.

5. Напишите реакции дегидрирования соединений:

R-СН 2 –СН 2 - R; R-СН=О; R- СНОН -R; R-СН=СН-R

6. Установите соответствие:

Редокс-потенциал: А.+0,82; Б. +0,10; В.+ 0,25; Г.- 0,22

Компонент ЦПЭ: 1.Убихинон; 2.Кислород; 3.ФМН; 4.Цитохром

7. Какие из перечисленных соединений являются субстратами ФАД-зависимой дегидрогеназы: глюкоза, сахароза; янтарная кислота; глицериновый альдегид, НАДН + .

8. Напишите схему переноса электронов и протонов от изоцитрата на кислород (изоцитратдегидрогеназа – НАД-зависимый фермент) и укажите

название всех ферментных комплексов.

9. Лекарственные препараты – производные барбитуровой кислоты:

А. Оказывают снотворное действие.

Б. Активируют тканевое дыхание.

В. Ингибируют НАДН-дегидрогнназу.

Д. Вызывают гипоэнергетическое состояние.

Введение

Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:

1. Методы определения активности ферментов.

2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.

3. Методы выделения и очистки ферментов.

4. Изучение субклеточной локализации ферментов.

5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.

Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.

Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.

Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы

Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):

Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:

5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 > 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 + 8H2O,

согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 - 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7 1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить = 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин - (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.

1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.

2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

(По А.Н. Баху и А.И. Опарину)

Все разнообразные превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются специфическими белками.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и при сравнительно низкой температура тела. Биологическое значение этого явления очень велико.

Для изучения действия ферментов необходимо выделить их из живых тканей. Обычно для этой цели подбирают легко доступный источник, богатый данным ферментом. Для того, чтобы перевести фермент в раствор, необходимо разрушить клеточные оболочки, что достигается с помощью гомогенизатора, растирания в ступке с пестиком, замораживания и оттаивания, автолиза и др. Обычно, разрушение клеточных оболочек производят при низкой температуре, благодаря чему приостанавливаются все ферментативные процессы в тканях.

К группе окислительно-восстановительных ферментов относится гемсодержащий ферменткаталаза , которая катализирует реакцию разложения перекиси водорода с освобождением молекулярного кислорода:

2 Н 2 О 2 --> 2 Н 2 О + О 2

Каталаза находится в большинстве тканей живого организма.

Принцип метода.

Перекись водорода разлагается каталазой. Избыток перекиси водорода титруют перманганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 --> 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

В опыте определяют количество оставшейся неразрушенной перекиси водорода, в контроле - общее количество взятой перекиси водорода (каталаза в контрольной пробе инактивирована кипячением).

Вычитая результаты опыта из результатов контроля, узнают количество разрушенной в определенный промежуток времени перекиси водорода, что позволяет судить об активности каталазы.

Оборудование: 1. Бюретки прямые на 50 и 100 мл (по 1 шт.)

2. Цилиндр на 10 мл

3. Ступка с пестиком

4. Конические колбы на 200-250 мл (2 шт.)

5. Технические весы с разновесами

6. Пипетка на 10 мл "вытяжка фермента"

7. Пипетка "H 2 SO 4 "

8. Кипящая водяная баня

9. Шпатель

10. Колба мерная на 100 мл

11. Воронка

12. Фильтровальная бумага

Материалы: 1. Свежий растительный материал (морковь или картофель)

2. 0.1н раствор Н 2 О 2

3. 0.1н раствор KMnO4

4. 10%-ный раствор H 2 SO 4

5. СаСО 3 (крист.)

6. Песок кварцевый

Ход работы:

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют.

В коническую колбу на 200 мл берут из бюретки 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0.1н раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшейся перекиси водорода.

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл) К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют 0.1н раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование всего количества пе­рекиси водорода.

По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной пе­рекиси водорода. Согласно уравнению реакции между KMnO 4 и H 2 O 2 , 1 мл 0.1н раствора перманганата калия соответствует 1.7 мг перекиси водорода.

Пример расчета.

Из 1.25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл. На титрование опытной пробы затрачено 15.5 мл,контрольной-30.2 мл 0.1н раствора перманганата калия. Количество разложенной перекиси водорода в пробе эквивалентно 30.2-15.5=14.7 мл 0.1н раствора перманганата калия и, следовательно, равно 14.7*1.7=24.99 мг.

В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 30 мин разложить (24.99*100)/(20*1.25)=99.96 мг перекиси водорода, а за 1 мин - 99.96/30=3.33 мг. Так как

1 мкмоль перекиси водорода составляет 0.034 мг, то в 1 г моркови присутствует 33.3/0.034=100 Е каталазы.

Лабораторная работа №4

Получение сахаразы из дрожжевых клеток. Специфичность действия ферментов.

Все разнообразные химические превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются с п е ц и ф и ч е с к и м и б е л к а м и.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и сравнительно при низкой температуре тела.

Изучение свойств ферментов, условий их действия, определение содержания ферментов в различных органах и тканях имеет большое значение для правильного понимания сложнейших процессов жизнедеятельности организма.

Одним из важнейших свойств ферментов является специфичность их действия в отношении определенного субстрата. Специфичность каталитических свойств ферментов проявляется в том, что фермент, как правило, действует лишь на определенное вещество. На строгую специфичность ферментов указывает и тот факт, что в случаях стереоизомерии определенный фермент катализирует расщепление только одного стереоизомера. Специфичность ферментов - их важнейшее биологическое свойство, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ.

В данной работе рассматриваются процессы расщепления ферментом сахаразой субстрата - сахарозы и расщепления крахмала ферментом - амилазой, которая содержится в слюне человека.

Экстракция сахаразы из дрожжевых клеток

Материалы и реактивы:

· Прессованные дрожжи– 10 г

· Гомогенизатор (ступка с пестиком)

· Кварцевый песок

· Вода дистиллированная

Ход работы

10 грамм сухих дрожжей поместить в ступку, добавить 10 мл дистиллированной воды и гомогенизировать в фарфоровой ступке с небольшим количеством кварцевого песка для разрушения клеточных стенок. Затем фарфоровую ступку с гомогенизатом поместить в сушильный шкаф с температурой 60 0 Сна 30-40 минут.

По истечении указанного времени вынуть ступку, охладить, добавить 30 мл дистиллированной воды и растереть содержимое ступки до однородной массы.

Затем гомогенизат, для осаждения клеточной массы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная надосадочная жидкость – экстракт сахаразы.