Отличия сложных методов окраски от простых методов. Нарисуем невидимое, или методы окраски микроорганизмов. Окраска по Граму
Окраска микроорганизмов (крашение микробов) - комплекс методов и приемов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов. Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности. После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.
// Общие сведения о методе
Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно - красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см. окраска по Граму).
Способы крашения разделяют на витальный, поствитальный и негативный, последний может быть витальным и поствитальным.
Витальный способ окраски
Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.
Поствитальные способы окраски
Способы крашения фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных способов крашения бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.
Для крашения простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.
Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.
По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями - в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.
// Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.
Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма - розовый или малиновый.
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Подготовка материала для окраски
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.
Фиксация
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.
Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % - 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40% формалин 5 мл, этиловый спирт 96° - 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40% формалина в течение нескольких секунд.
Процесс окрашивания мазков
На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2-3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1-2 минуты до почернения препарата.
Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20-40-60 секунд).
Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2-5 мин).
Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту
Депарафинированные срезы доводят до воды.
Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.
Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
Промокают фильтровальной бумагой.
Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 - 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
Проводят через 3 смены ксилола
Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.
Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.
Метод Пешкова применяется для окраски эндоспор бактерий.
Техника окрашивания
Высушенный препарат из культуры грамположительных бактерий фиксируют в жидкости Карнуа в течение 15 минут, затем промывают водой, наливают метиленовый синий по Леффлеру и нагревают до появления паров, кипятят 15-20 минут, после охлаждения препарата промывают и докрашивают 0,5% водным раствором нейтрального красного или фуксина по Пфейферу 30-60 секунд. Высушивают с помощью фильтровальной бумаги и микроскопируют.
Результат окрашивания
В результате зрелые эндоспоры окрашиваются в голубой цвет, молодые - в темно-синий, цитоплазма красная, зерна хроматина окрашиваются в фиолетовый цвет.
Метод окраски по Цилю - Нельсену - метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат феноловый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.
Метод назван именами немецких медиков - микробиолога Франца Циля (1857-1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854-1898), которые разработали его в 1882-1883 гг.
Этапы окраски
1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё феноловый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2-3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты или 3% солянокислого спирта и промывают несколько раз водой.
3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 3-5 минут, промывают водой и высушивают.
При окраске по методу Циля - Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.
Окраска по Романовскому - Гимзе цитологический метод окраски простейших, бактерий, клеточных структур и тканей различных видов (в том числе крови) при световой микроскопии. Окрашивает ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные - в цвета от пурпурного до синего.
// Приготовление красителя
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 37 °C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
Методика окраски
Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2.
Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.
Результат окраски
Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый.
Вопрос 5. Простые и сложные методы окраски. Подразделение сложных методов окраски по назначению. Протравы и дифференцирующие вещества. Метод Грама: сущность, этапы окраски, практическое применение.
Ответ: Простой метод окраски является одноэтапным (1 краситель –анилиновые, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде растворов или пропитанных бумажек). Окраска 3-5 минут, промывание, высушивание, микроскопия. Можно получить представление о форме, размерах, расположении (но не о деталях строения).
Сложные
Дифференциальные - позволяющие отличить один вид или группу бактерий от других (по Грамму – характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена - кислотоустойчивые).
Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)
Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие
(спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).
Окраска по Грамму.
|
цель метода |
Выявление грамположительных и грамотрицательных бактерий |
|
основной краситель |
карболовый раствор генцианвиолета |
|
протрава |
раствор Люголя (после окрашивания) |
|
дифференцирующее вещество | |
|
дополнительный краситель |
разбавленный карболовый раствор фуксина |
|
в пламени спиртовки до окрашивания |
|
|
этапы окраски |
Окрасить раствором генцианвиолета 1 мин. (или с бумажкой – 3 мин.); Нанести на мазок раствор Люголя – 1 мин.; Промыть в этаноле 30 сек.; Промыть водой; Окрасить раствором фуксина 1 мин. (или с бумажкой – 5 мин.); Промыть водой; Высушить |
|
сущность метода |
Генцианвиолет образует комплекс с тейхоевыми кислотами в присутствии Люголя, который задерживается многослойным пептидогликаном у грамположительных бактерий. При дополнительной окраске фуксином грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет. |
Вопрос 6. Сложные методы окраски, протравы и дифференцирующие вещества. Метод Циля-Нильсена: сущность, этапы окраски, практическое применение.
Ответ: Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:
Дифференциальные (отличить группы (по Грамму - характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена -кислотоустойчивые).
Предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).
Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают
окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)
Дифференцирующие вещества - вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие (спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).
Метод Циля-Нильсона:
|
цель метода |
Выявление кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий |
|
основной краситель |
карболовый раствор фуксина |
|
протрава |
карболовая кислота (в момент окрашивания) |
|
дифференцирующее вещество |
серная кислота |
|
дополнительный краситель |
водный раствор метиленового синего |
|
способ фиксации препарата-мазка |
в пламени спиртовки в процессе окраски |
|
этапы окраски |
Окрашивать карболовым раствором фуксина (фуксин Циля) через фильтровальную бумажку при осторожном нагревании над пламенем спиртовки 3 раза до появления паров белого цвета (1); Промыть в 5% серной кислоте; Промыть водой; Окрасить раствором метиленового синего 1 мин.; Промыть водой; Высушить |
|
сущность метода |
При частичном гидролизе клеточной стенки фуксин взаимодействует с миколовыми кислотами и образует комплекс в присутствии фенола. Фенол разрыхляет бактериальную оболочку и краска проникает внутрь клетки. Кислотоустойчивые -красные, некислотоустойчивые - синие |
Практическое применение : для диагностики заболеваний (туберкулез)
Вопрос 7. Клеточная стенка бактерий: особенности строения у грамположительных и грамотрицательных бактерий, функции, методы выявления. Особенности строения клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий. L -формы бактерий.
Ответ:
Клеточная стенка. Располагается над ЦПМ.
КС обеспечивает постоянную форму клетки, механическую и осмотическую защиту, взаимосвязь с окружающей средой, несет рецепторы для бактериофагов.
Отдельные соединения в составе КС обладают целым спектром иммунобиологических свойств : участвуют в адгезии, угнетении фагоцитоза, обладают иммуномодулирующей активностью и т.д.
Химический состав и строение клеточной стенки постоянны и являются важным таксономическим признаком.
В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Основа -пептидогликан , обеспечивающий ригидность и эластичность КС.
Структура: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных между собой посредством гликозидных связей.
К каждому остатку N-ацетилмурамовой кислоты присоединен короткий пептид из 4-5 аминокислот.
Две особенности пептидного хвоста заслуживают внимания: наличие аминокислот в D-форме (неприродная конфигурация) и высокое содержание аминокислот с двумя аминогруппами. Это имеет принципиальное значение для пространственной организации пептидогликана. Обе аминогруппы этих аминокислот могут участвовать в образовании пептидных связей.
У грамположительных эубактерий он составляет основную массу вещества клеточной стенки (от 40 до 90%), у грамотрицательных - содержание пептидогликана значительно меньше (1-10%).
Функции клеточной стенки:
Обусловливает форму клетки.
Защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление.
Обладает свойством полупроницаемости, поэтому через нее избирательно проникают из среды питательные вещества.
Несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов и различных химических веществ.
Особенности строения КС Гр+
Клеточная стенка грамположительных бактерий достаточно плотно прилегает к ЦПМ.
Пептидные сшивки в пептидогликане обеспечивают его трехмерную пространственную организацию.
Многослойный пептидогликан пронизывают тейхоевые кислоты – полифосфатные соединения на основе рибитола или глицерина.
Тейхоевые кислоты ковалентно могут соединяться с N-ацетилмурамовой кислотой (собственно тейхоевые или стеночные) или с гликолипидом ЦПМ (липотейхоевые).
Свободные гидроксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства полианиона, определяющего поверхностный заряд клетки.
Особенности строения КС Гр-
Пептидогликан образует только тонкий внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегающий к ЦПМ.
У большинства видов пептидогликан образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями.
Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (ЛПС).
ЛПС сложного молекулярного строения, занимает около 30-40% поверхности наружной мембраны и является ее важнейшим компонентом.
Методом выявления клеточной стенки является метод Пешкова (КС –красная; цитоплазма –розовая), по Грамму-тип стоения клеточной стенки.
Метод выявления клеточной стенки: Метод Пешкова
Этапы окраски :
1.мазок протравливать в 10% растворе танина 6-8 мин
2.промыть водой
3.окрашивать водным раствором фуксина 30-60 сек
4.высушить
Сущность метода : танин уплотняет клеточную стенку бактерий, и большая часть фуксина задерживается в ней
Цель : выявление клеточной стенки. КС - красная, цитоплазма -розовая
Особенности клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий
Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий содержит большое количество липидов и восков, делающих их устойчивыми к последующему после окрашивания обесцвечиванию кислотами, щелочами или этанолом (например, виды Mycobacterium или Nocardia). Для их окраски применяют метод Циля-Нильсена .
L-формы
Если бактерии частично или полностью утратили клеточную стенку, но сохранили способность к размножению, они называются L-формами.
L-формы бактерий образуются под воздействием препаратов, ингибирующих синтез пептидогликана (антибиотик пенициллин) или разрушающих пептидогликан (лизоцим).
Изучают L-формы в фазово-контрастном микроскопе
Воспрос 8. Капсула бактерий: химическая природа, строение, функции, значение. Методы выявления капсул. Примеры инкапсулированных бактерий.
Капсула бактерий располагается поверх клеточной стенки. Она защищает бактериальную клетку во внешней среде от механического повреждения, высыхания, ядовитых веществ, бактериофагов, фагоцитов(в инфицированном организме). Выявление: в мазках-отпечатках из органов зараженных животных(простой метод, метод Грама). Тела бактерий окрашены на фоне окрасившейся ткани органа,окружены белым ореолом капсулы(капсула не окрашивается). Метод Бурри-Гинса (для окраски чистой культуры капсульных бактерий).
Метод выявления капсул: метод Бурри-Гинса
Цель метода : выявление капсулы у бактерий
Этапы окраски :
1.в каплю туши добавить каплю жидкости с микроорганизмами и растереть тонким слоем как мазок крови
2.высушить и зафиксировать в пламени горелки
3.окрасить карболовым фуксином 1мин
4.высушить
Сущность метода : капсула не окрашивается, задерживает тушь на поверхности, а фуксин окрашивает бактериальную клетку
Пример инкапсулированных бактерий : Klebsiella pneumoniae , Bacillus cereus
Воспрос 9. Жгутики у бактерий: строение, типы расположения, функции, способы выявления. Ворсинки: фимбрии, пили, подразделение, строение, функции. Примеры бактерий.
Жгутики являются органами движениями, представляют собой нитевидные придатки,состоят из белка флагеллина; прикрепляется к бакт.клетке с помощью базального тельца(система дисков и крючка, к которому прикреплена жгутиковая нить). Монотрихи (один жгутик),перитрихи (жгутики по всей поверхности бакт клетки), лофотрихи (пучок жгутиков на одном конце клетки), амфитрихи (единичные жгутики или пучки на разных полюсах клетки). Способы выявления: метод серебрения(жгутики искусственно утолщаются и становятся видимыми в иммерсионном микроскопе); наличие жгутиков определяется по активной подвижности микробных клеток.
Ворсинки(фимбрии и пили) состоят из белка пилина, видны только в электронном микросопе(тонкие и короткие). F -пили (половые, обеспечивают конъюгацию междубактериями);фимбрии общего порядка (адгезия).
Примеры бактерий: Половые пили Е. соli
Salmonella Typhi - перитрихи
Vibrio cholerae - монотрихи
Campylobacter jejuni - лофотрихи или амфитрихи
Воспрос 10. Споры бактерий: типы расположения спор в клетке, строение споры. Причины устойчивости спор к воздействию факторов внешней среды. Методы выявления спор. Примеры спорообразующих бактерий.
Эндоспора- являются приспособлением бактерий для сохранения вида в неблагоприятных условиях внешней среды. В одной бактериальной клетке образуется только одна спора! Такой способностью обладают бактерии рода Bacillus и Clostridium . (Bacillus – центральное расположение спор, не превышают поперечник клетки; Clostridium-крупные споры, субтерминально/терминально,в месте нахождения споры клетка раздувается, приобретая веретенообразную форму).Высокая резистентность ,причины: низкое содержание свободной воды, высокое содержание кальция,наличие дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином,наличие нескольких оболочек). Окрашивание спор-метод Ожешки.(на высушенный мазок наложить фильтовальную бумажку, налить 0,5% раствор соляной кислоты и нагревать над пламенем спиртовки до появления пара 3 раза;далее окрашивать по Цилю- Нильсену.(Вегетативные клетки в готовом мазке-голубого цвета,споры-рубиново-красные).
Воспрос 11. Ультраструктура бактериальной клетки. Строение цитоплазматической мембраны, функции, методы выявления. Особенности строения наружной мембраны грамотрицательных бактерий.
ЦМП-основной барьер,который ограничивает протопласт бактерий,выявляется только в электронном микроскопе;состоит из двойного слоя фосфолипидов,куда включены интегральные и неинтегральные белки;от мембраны эукариот отличается отсутствием стеролов.
Функции : участвует в процессах избирательного активного транспорта молекул из внешней среды, является осмотическим барьером и осмотическим мостиком, выделяет гидролитические ферменты, в ее состав входят ферменты электрнонно-транспортной цепи,с ней связана АТФ-аза, содержит ферменты комплекса репликации ДНК нуклеоида,в ней фиксируются жгутики и ворсинки,имеет ферментный аппарат,участвующий в синтезе своих собственных структур, клеточной стенки.
Мезосомы - инвагинации ЦПМ внутрь клетки. Играют роль в репликации хромосомы и ее последующем расхождении по дочерним клеткам, разграничивает внутреннее содержимое на отсеки. Мезосомы грамотрицательных бактерий-простые инвагинации, грамположительных имеют сложную морфологию (везикулярные,трубчатые,пластинчатые).
Наружная мембрана грамотрицательных бактерий связана посредством липопротеина с подлежащим тонким слоем пептидогликана; внутренний компонент-фосфолипидный бислой, в наружном расположен липополисахарид (является О-антигеном, состоит из: липида А-консервативная структура; ядра, или стержневой, коровой части-олигосахаридная структура; высоковариабельного О-специфического олигосахарида). Белки- порины пронизывают мембрану, образуя гидрофильные поры, также являются рецепторами для бактериофагов.(из учебника)
Воспрос 12. Ультраструктура бактериальной клетки. Рибосомы: строение рибосом у прокариот, функции. Отличия в строении рибосом эукариотических клеток. Цитоплазматические включения у бактерий: химическая природа, функции, способы выявления, значение.
Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица). S - это коэффициент седиментации, который характеризует скорость перемещения молекул или частиц в центробежном поле при центрифугировании. Рибосомы рассеяны по всей цитоплазме
В клетке эукариот имеют 80S рибосомы прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму. Функция: синтез белков
Включения- зерна волютина,содержащие поли- и мета-фосфаты. (Corynebacterium diphtheria). Окрашиваются простым методом Леффлера(окраска фиксированного в пламени горелки мазка щелочным мителеновым синим 5 мин. Тела бактерий-голубые,зерна волютина- темно-синие ) и сложным методом Нейссера (фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают уксусно-кислой синькой в течении 1 минуты,промывают водой,протравливают раствором Люголя 30 скекунд и докрашивают везувином. Препарат промывают водой, высушивают, микроскопируют. Тела бактерий-желтые , зерна волютина- темно-синий цвет , расположены на обоих концах клетки) .
Воспрос 13. Ультраструктура бактериальной клетки. Нуклеоид бактерий: строение, функции и методы выявления. Особенности организации генетического аппарата прокариот и эукариот.
Нуклеоид у прокариот - генетический аппарат бактерий не имеет ядерной оболочки и представлен одной кольцевой двунитевой суперспирализованной молекулой ДНК,которая является хромосомой; располагается в цитоплазме,не содержит белков гистонов. Не способен к митозу
Генетический аппарат всех эукариот находится в ядре и защищён ядерной оболочкой.ДНК эукариот линейная. Хромосомы как структуры. Содержит белки-гистоны. Способен к митозу
Выявляют при электронной микроскопии, Романовского- Гимзы.
метод Романовского-Гимзы
Цель метода : выявление нуклеоида; нуклеоид - сине-фиолетовый; цитоплазма - розовая
Сущность метода : Амур и метиленовый синий окрашивает участки клетки со слабощелочным pH , эозин с кислым
Этапы окраски :
1.провести кислотный гидролиз в растворе соляной кислоты при нагревании
2.промыть водой
3.окрашивать краской Романовского-Гимзы 40-60 мин
4.высушить
14. Актиномицеты : морфология чистой культуры и структура друзы актиномицетов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.
Актиномицеты - группа нитчатых грамположительных прокариот. Виды актиномицет представляют собой тонкие неспорообразующие полиморфные палочки и нити(гифы) с ветвлением; гифы переплетаясь, образуют мицелий.
Актиномицет у здорового человека обитают в полости рта и кишечном тракте, не причиняя ему вреда, но снижение иммунитета организма может вызвать заболевание - актиномикоз (развиваются гнойные хронические процессы с поражением любых органов и тканей).
В пораженном организме актиномицеты образуют друзы , имеющие звездчатую, лучистую форму. Центр друзы состоит из компактного кальцинированного плотного мицелия, а периферийные гифы покрыты капсулоподобными эозинофильными чехлами, выполняющими защитную функцию.
Для изучения актиномицет применяют методы Грама и Циля-Нильсена
15. Микоплазмы : таксономия, строение клетки, особенности морфологии, биологические свойства, методы культивирования и выявления. Роль в инфекционной патологии человека.
Ответ : Класс - Mollicutes
Порядок - Mycoplasmatales
Семейство - Mycoplasmataceae
Род - Mycoplasma
Микоплазмы - полиморфные микроорганизмы, отличающиеся от других прокариотов отсутствием клеточной стенки
Поверхностной оболочкой микоплазм является цитоплазматическая мембрана, более прочная и эластичная (т.к. в ней присутствует холестерин). Клетки микоплазм содержат нуклеоид(самый маленький), рибосомы, цитоплазму и цпм (без мезосом). У некоторых микоплазм обнаружены микроворсинки (Mycoplasma pneumoniae) и нитчатые выросты различной длины, которые принимают участие в скользящем движении клеток и адгезии.
Для культивирования микоплазм используют специальные полужидкие среды , на которых через 2-4 недели получают видимый рост в виде колоний, напоминающий "яичницу- глазунью"(из-за хрупкости микоплазм - т.к. Отсутствует клеточная стенка).Их изучают в нативных препаратах в фазово-контрастном микроскопе (не удается окрасить из-за хрупкости)
16. Риккетсии : таксономия, биологические свойства, морфологические формы, методы окраски, методы культивирования. Жизненный цикл риккетсий. Роль риккетсий в патологии человека (назовите заболевания и соответствующих им возбудителей).
Ответ : Царство - Bacteria
Порядок - Rickettsiales
Семейство - Rickettsiaceae
Род - Rickettsia
Риккетсии - грамотрицательные полиморфные бактериоподобные прокариоты,капсул,спор не образуют. Облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на простых питательных средах. Жизненный цикл риккетсий включет 2 стадии - вегетативную и покоящуюся . В вегетативной стадии риккетсии активно размножаются путем бинарного деления; покоящаяся форма обладает повышенной резистентностью(меньших размеров, с утолщенной клеточной стенкой).
Различают 4 морфологические формы риккетсий (по Здродовскому ) :
Кокковидную (d= 0,3-0,4мкм)
Палочкивидную (1-2 мкм)
Бациллярную(3-5 мкм)
Нитевидную(до 40 мкм)
Риккетсии культивируются в желточных мешках куриных эмбрионов, перевиваемых культурах клеток, легких белых мышей. Риккетсии можно культивировать путем инфицирования ими переносчиков возбудителей инфекций - вшей, блох, клещей. Для окраски риккетсий применяют сложные методы - Романовского-Гимзы и Здродовкого
Методика окраски :
1.фиксированный в пламени горелки мазок окрашивают разведенным карболовым фуксином Циля(без нагревания)
2.промывают водой
3.обесцвечивают слабым раствором органической 0,5% лимонной к-ты, 0,15% уксусной к-ты или минеральной кислоты (0,01% HCL)
4.промывают водой и докрашивают водным раствором метиленового синего
Результат окраски : риккетсии - в рубиново-красный; цитоплазма - голубая; ядро - синее
Патогенные для человека риккетсии являются возбудители риккетсиозов, для которых характерны сыпнотифозные или пятнистые лихорадки. Например, Rickettsia prowazekii вызывает эпидемический вшивый сыпной тиф.
17. Хламидии : таксономия, морфология и ультраструктура, жизненный цикл. Методы выявления и культивирования. Роль в инфекционной патологии человека.
Ответ : Семейство - Chlamydiaceae
Род - Chlamydia
ЭТ - внеклеточная инфекционная частица (0,2-0,4 мкм), содержит компактный нуклеоид, рибосомы, жесткую клеточную стенку. ЭТ проникает в чувствительную клетку путем эндоцитоза, вокруг него образуется вакуоль. Внутри вакуоли ЭТ разбухает, приобретает сетчатую структуру, увеличивается до 0,5-1,5 мкм и превращается в РТ.
РТ внутри вакуоли многократно делится путем образование поперечных перегородок. Вакуоль заполняется микро-колониями хламидий, содержащих большое количество РТ в процессе деления, промежуточные тельца и ЭТ. Вакуоль превращается во внутриклеточное включение, покрытое оболочкой - хламидой, расположенное в цитоплазме клетки-хозяина. Выход хламидий из клетки - через неповрежденную мембрану или при гибели клетки. Освободившиеся ЭТ внедряются в другие здоровые клетки, где цикл развития повторяется.
Изучают хламидии в живом состоянии, в фазово-контрастном микроскопе и окрашивают методом Романовского-Гимзы (ЭТ - розовые, РТ - сине-голубые).
Патогенны: Chlamydia trachomatis (трахома и урогенитальные инфекции), Chlamydia pneumoniae (респираторные инфекции), Chlamydia psittaci (орнитоз).
18. Спирохеты : таксономия, биологические свойства, ультраструктура клетки, цисты. Методы изучения спирохет нативных и окрашенных препаратов. Роль спирохет в инфекционной патологии человека.
Семейство – Spirochaetaceae
Спирохеты - тонкие нитевидные, спирально извитые микроорганизмы, обладающие активной подвижностью. Относятся к грамотрицательным прокариотам. Клеточная стенка эластичная, что позволяет им совершать колебательные, вращательные и сгибательные движения.
Двигательный аппарат представляет собой фибриллярный тяж, состоящий из 2х пучков фибрилл, расположенных субтерминально на обоих концах клетки. Фибриллы пролегают в клеточной стенке, обвивая цитоплазматический цилиндр (протопласт). В середине клетки фибриллы перекрывают друг друга. Фибриллы состоят из белка флагеллина.
Спирохеты изучают в нативных препаратах, используя темно-польную микроскопию для выявления их форм и подвижности. Их Ультраструктуру изучают с помощью электронной микроскопии. Для изучения спирохет в окрашенном состоянии применяют: метод Романовского-Гимзы (боррелии в сине-фиолетовый, трепонемы в бледно-розовый, лептоспиры в красно-розовый), метод серебрения по Морозову (спирохеты имеют вид тесно-коричневых спиралей на светло-желтом фоне препарате),негативный способ Бурри (тушь не проникает тела микробов,на темном фоне белые контуры спирохет)
существенную роль в инфекционной патологии человека играют роды Treponema, Borrelia и Leptospira. Treponema pallidum - возбудитель сифилиса, Borrelia recurrentis - возбудитель возвратного тифа, Leptospira interrogans является возбудителем лептоспироза
19. Микроскопические грибы : морфология, ультраструктура. Размножение плесневых и дрожжевых грибов. Методы изучения. Роль в инфекционной патологии человека.
Протопласты (содержимое клетки, заключенное в клеточную стенку) клетки грибов содержат ядро с ядрышком, митохондрии, лизосомы, эндоплазматический ретикулум, рибосомы, фагосомы, вакуоли и др. Снаружи протопласты покрыты ЦПМ с высоким содержанием стеролов (главным образом эргостерола) и плотной клеточной стенкой,в состав которой входят хитин, целлюлоза, глюкуроновая кислота, глюканы, различные углеводы, липиды, белки, пигменты.
По морфологическим особенностям грибы подразделяются на группы: плесневые грибы и дрожжеподобные грибы
Плесневые грибы образуют мицелий (тело гриба), который состоит из переплетенных гифов. На питательной среде плесневые грибы образуют субстратный мицелий, который прорастает в нее, извлекая из среды все необходимые для роста и размножения вещества, и воздушный мицелий,на котором созревают неполовые споры,с помощью которых грибы размножаются. Бесполовой путь у плесневых грибов характеризуется образованием большого количества экзоспор или эндоспор. Многие грибы могут размножаться и половыми спорами(половым путем).
Дрожжевые грибы размножаются почкованием.
Морфологию грибов изучают в нативных препаратах "раздавленная капля" в затемненном поле зрения, фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе и с помощью окраски простым методом, по Граму, Цилю-Нильсену,Нейссеру
Заболевания вызываемые микроскопическими грибами - микозы.Грибковое заболевание Кандидоз - вызывается Candida albicans
РАЗДЕЛ ФИЗИОЛОГИЯ.
Клеточная стенка бактерий является их важным отличительным признаком.
В целях более подробного изучения клеточных структур бактерий микробиологические препараты окрашивают. Можно окрашивать живые бактериальные формы, однако такая окраска не даёт полной картины строения микробной клетки. В связи с этим приготавливают фиксированные препараты микроорганизмов. Фиксация убивает живые клетки и одновременно закрепляет их на поверхности предметного стекла.
Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.
Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы быстро высыхал после приготовления.
Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.
Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка.
Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.
Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин , эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители.
Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.
Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 - 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.
По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.
Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.
Форму клеток и их расположение (цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светло-польной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий, таких как Serratia marcescens , готовят препарат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мелких бактерий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter , Labrys , Prosthecomicrobium , Stella и некоторые другие), целесообразно исследовать методом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток».
Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.
Окраска по Граму (сложное окрашивание микроорганизмов) и ее использование для дифференциации бактерий с различным строением клеточной стенки.
Данный сложный (использующий более одного действующего вещества) метод окраски впервые был предложен в 1884г. датским ученым Х. Грамом (Ch.Gram) для окрашивания тканей, а позднее получил широкое распространение при окраске прокариот и был назван именем его разработчика.
Важное значение метода окраски по Граму в микробиологии определяется тем, что результаты окрашивания бактерий оказываются напрямую связанными с особенностями строения их клеточных стенок. Объяснением этого являются выраженные различия в строении клеточных стенок грамположительных (по данному методу окрашивающихся в фиолетовый цвет) и грамотрицательных (по данному методу окрашивающихся в красный цвет)бактерий. Первые из них имеют достаточно толстые слои из муреина (у эубактерий) или псевдомуреина (у архебактерий), удерживающие образующийся в протопласте комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и препятствующие его вымыванию из клетки при последующей обработке спиртом.
В свою очередь грамотрицательные бактерии не образуют подобных гетерополисахаридов или содержат их в небольших количествах, недостаточных для предотвращения экстрагирования комплекса красителя с йодом из протопласта при его обработке спиртом. Сказанное объясняет, почему несмотря на кажущуюся простоту метода Грама, именно он получил наибольшее распространение в качестве важного таксономически значимого теста, с результатами которого хорошо коррелируют многие прочие свойства прокариот.
Для реализации данного метода готовят специальный краситель - карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового: 1 г красителя растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96 % спирта, окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают в бутыль, отстаивают и через сутки фильтруют. Вторым важным компонентом для окраски по Граму является раствор Люголя : в 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г иодида калия и 1 г иода кристаллического, смесь хорошо укупоривают и оставляют на сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды.
Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток красителем кристаллическим фиолетовым, за чем следует обработка клеток раствором иода. Эти два компонента вместе образуют крупномолекулярный комплекс, нерастворимый в воде и слабо растворимый в спирте. Поэтому, используя спирт, клетки дифференцируют: при промывании в нем «грамположительные» клетки удерживают комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и остаются синими, а «грамотрицательные» обесцвечиваются. Для того же, чтобы также сделать их видимыми, образцы дополнительно окрашивают каким-либо контрастным красным красителем - обычно фуксином.
Среди множества предложенных в настоящее время вариантов, окрашивания по Граму (по Г.П. Калине, по Эткинсу и др.) достаточно широкое распространение получила модификацияпо А.И. Синеву , для реализации которой предварительно готовят полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового и высушенной.
Процедура сложного окрашивания микроорганизмов:
1) на предметном стекле готовят мазок бактериальной культуры, который фиксируют над пламенем горелки;
2) на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового, на который наносят 2-3 капли воды и выдерживают в течение 2 мин;
3) снимают фильтровальную бумагу;
4) не смывая водой (!) на препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и выдерживают в течение 1 мин;
5) сливают раствор Люголя;
6) опускают предметное стекло в стаканчик с 95 % спиртом, где тщательно прополаскивают препарат в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель;
7) тщательно промывают препарат водой;
8) наносят на предметное стекло раствор водного фуксина и прокрашивают препарат в течение 0,5-1 минут;
9) краситель сливают, тщательно промывают препарат водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.
Считается, что в большинстве случаев интерпретация результатов окраски мазка по Граму не представляет трудностей, однако некоторые грамположительные микроорганизмы, в частности представители рода Bacillus , могут иметь грамотрицательную окраску. Напротив, некоторые штаммы грамотрицательных родов Acinetobacter и Moraxella проявляют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, поэтому выглядят грамположительными.
Для уточнения таких «грам-сомнительных» реакций предложены особые методы. В Японии предложили метод «тяжа», позволяющий отличить с помощью КОН-теста грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода с КОН лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии.
Методика выполнения работы .
На предметное стекло наносят каплю 3 %-ного водного раствора КОН. Петлей вносят суточную агаровую культуру исследуемых бактерий и тщательно эмульгируют. При положительной реакции, если суспензия в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петлей на 0,5 - 2,0 см и даже дальше, это - грамотрицательные бактерии, если нет - грамположительные бактерии. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.
Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из их клеток ДНК, являющейся вязким компонентом.
При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.
1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.
12. Окраска по Граму, техника, назначение. Отличие грам- и грам+ бактерий.
Метод Грама - метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.
По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями - генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями - в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.
Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет. Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма - розовый или малиновый.
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой - дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют красители: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Отличие грам+ и грам- бактерий
У грамположительных бактерий клеточные стенки содержат мало липидов, а у грамотрицательных клеточные стенки, напротив богаты липидами. И у тех и у других жесткий каркас образуется в результате ковалентного связывания полисахаридных и пептидных цепей. Однако, к этой структурной основе присоединяются некоторые специфические для данной бактерии компоненты, которые у грамположительных и грамотрицательных бактерий имеют разный состав.
Стенки бактериальных клеток содержат еще и некоторые сопутствующие компоненты, которые у разных бактерий варьируются. У грамположительных бактерий это тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды или белки. У грамотрицательных бактерий больше сопутствующих компонентов, вплетенных в муреиновую сеть. Это полипептиды, липопротеины, сложные липополисахариды. Все эти компоненты наделяют клетки грамотрицательных бактерий сложной антигенной специфичностью, а также акцепторной специфичностью по отношению к вирусам.
Таким образом, клеточная стенка грамположительной бактерии представляет собой жесткий хрупкий корпус бактерии, а клеточные стенки грамотрицательных бактерий имеют мягкое покрытие, богатое липидами и укрывающее лежащий под ними муреиновый скелет.
Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.
Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.
Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.
Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окраска по Граму:
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.
При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.
Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:
1. Грамположительные бактерии:
— кокки (за исключением гонококков и менингококков);
— бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);
— микобактерии, коринебактерии и листерии.
2. Грамотрицательные бактерии:
— некоторые кокки (гонококки и менингококки);
— все остальные палочковидные бактерии;
— все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).
Структура бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:
— основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);
— временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).
Основные структуры.
Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:
— защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;
— определение формы бактерий;
— участие в метаболизме бактерий;
— токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);
— наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).
В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.
Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма ) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана ) состоит из липополисахарида , белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами . У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.
В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты — это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий — это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) — это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко-личество углеводов.
ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:
— барьерная функция (молекулярное “сито”);
— избирательный перенос раз-личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;
— превращение клеточ-ной энергии;
— репликация и последующее разделение хро-мосомы.
В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом . По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.
Цитоплазма — это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.
Цитозоль — гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.
Структурные элементы — это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.
Рибосомы — органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.
В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включе-ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество — гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы-ваемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.
Нуклеоид является аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.
Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).
К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.
Капсула — это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.
Функции капсулы:
— место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;
— защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;
— способность прикрепления клеток к субстрату.
Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:
— монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;
— амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
— лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;
— перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .
К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.
У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях — эндоспо-ры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.
Расположение спор в клетке:
— центральное (возбудитель сибирской язвы);
— субтерминальное — ближе к концу (возбудитель ботулизма);
— терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).
Читайте также:
Окраска микроорганизмов (крашение микробов) - комплекс методов и приёмов для исследования внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, метод микробиологической техники, позволяющий различать виды микроорганизмов.
Метод широко используют в прикладной бактериологии для определения формы, размеров, строения, локализации, взаимного расположения микробов, структуры их органелл. Без окраски микробы, кроме некоторых грибов, в световой микроскоп практически не видны, вследствие их малой контрастности.
После обработки мембраны и/или органеллы микробов приобретают контрастирующую с фоном окраску.
Препараты микробов подвергают действию химических реагентов, обычно - красителей, или тетраоксида осмия. В результате физико-химического процесса взаимодействия красителя с химическими соединениями объектов, с целью искусственного придания ему определённой окраски, появляется возможность определить вид микроорганизма, или хотя бы тип его мембраны (см.
окраска по Граму).
Способы крашения разделяют на витальный , поствитальный и негативный , последний может быть витальным и поствитальным.
Витальный способ окраски
Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры.
Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.
Поствитальные способы окраски
Способы окраски фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые
и сложные
. При простых
способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.
Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.
Из сложных
способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсену, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.
Для окраски простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин-эозином.
Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.
См. также
Литература
- Барыкина Р.
П. и др. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с. - 2000 экз. - ISBN 5-211-06103-9. - УДК 58:57.08
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю - Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение.
Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые).
Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток.
Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе.
Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.
Механизм и этапы окраски по Граму
На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.
2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)
Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промыть водой
5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный.
Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону
На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин
2. Снять бумагу, провыть мазок водой
3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промыть водой
5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин
Промыть водой, высушить и микроскопировать
* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окр. метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.
Возбудитель чумы
Возбудитель – Yersinia pestis.
грамотрицательные палочки, овоидной формы, окрашиваются биполярно.
Подвижны, имеют капсулу, спор не образуют Факультативные анаэробы. Хорошо культивируются на простых питательных средах. Ферментируют большинство углеводов без образования газа. Два типа колоний — молодые и зрелые. Молодые с неровными краями. Зрелые колонии крупные, с бурым зернистым центром и неровными краями.
Биохимические свойства: фенментативная активнсть высокая: ферментация до кислоты ксилозу, синтез плазмокоагулазы, фибринолизина, гемолизина, лецитиназу, сероводород.
чувствителен к антибиотикам нестоек к окружающей среде при высокой температуре.
Клинические особенности: Инкубационный период – несколько часов до 8 сут. Различают локальные – кожно-бубонная, бубонная; внешне-диссеминированные – первично-легочная, вторично-легочная и кишечная; генерализованная – первично-септическая, вторично-септическая формы чумы. Региональная лимфоаденопатия, энтероколиты, реактивные артриты, спондилит, лихорадка.
Эпидемиология: Чума — классический природноочаговый зооноз диких животных.
Основные носители в природе — сурки, суслики, в городских условиях — крысы. В передаче возбудителя — блохи животных, способные заражать человека.
Иммунитет: клеточно-гуморальный, ограничен по длительности
Микробиологическая диагностика:
Бактериоскопическое исследование.
Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и водным раствором метиленового синего. Бактерии чумы представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. На бульоне бактерии образуют пленку; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают.
Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.
Экспресс-методы лабораторной диагностики:
2.РПГА — для обнаружения антигенов бактерий в материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.
Лечение: антибиотики Профилактика: специфическая профилактика — живая ослабленная чумная вакцина EV.
Чумной бактериофаг – при идентификации Y.pestis.
Чумная сухая вакцина – высушенная живая культура Y.pestis вакцинного штамма EV, используется для профилактики чумы.